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篇（1）

Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods

By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions

MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.

Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro

近年研究發現，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細胞－衛星細胞，而且還含有多能的“肌源性干細胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細胞起源于胚胎血管祖細胞，在適當的微環境中，可分化為血細胞、成骨細胞、神經細胞等不同胚層的組織細胞，MDSCs的表面標志已被初步認識，對其分化的研究，及其分離純化的技術研究正在進一步深入 ［1-3］。本實驗經過技術改良，通過體外原代培養獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國產)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。

1.2 原代MDSCs的取材、分離純化 參照參考文獻所報道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復吹打后濾過200目的篩網，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細胞團塊用生長培養基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養瓶中，該培養瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細胞培養箱中靜置過夜，隨后將懸液轉移到另一個膠原包被的培養瓶中培養，此為PP2。此后連續4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉移至新的培養瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進一步的鑒定實驗，細胞在達到約70%匯合時必須傳代。

1.3 MDSCs生長曲線的繪制 取PP6傳至第2代細胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個／孔接種于24孔培養板。每日取3孔消化后，進行細胞記數，共7日根據記數結果繪制細胞生長曲線。

2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫熒光鑒定 取PP6中的MDSCs培養到第3代時，把細胞培養在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細胞生長達70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。

2 結

果

2.1 分離細胞的形態、生長特性 PP1、PP2（圖1A）貼壁細胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細胞，其余是寬大而呈星形或不規則的雜細胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細胞貼壁，成纖維細胞較少。隨著純化的繼續，圓形或短梭形細胞的數量明顯增加，到PP6（圖1C）時超過80%，這些細胞貼壁后絕大多數為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強。少數細胞呈多角形， 有突起。隨培養時間延長，細胞增殖、遷移逐漸形成規律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，若不加以控制及時傳代，細胞可迅速融合成細胞鏈或聚成團塊生長，細胞增殖速度減慢， 細胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A PP1、PP2貼壁細胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細胞和寬大而呈星形或不規則的雜細胞×200

圖1B PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細胞貼壁，成纖維細胞較少×200

圖1C PP6圓形或短梭形細胞的數量明顯增加，超過80% ×200

圖1D 細胞增殖、遷移逐漸形成規律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，細胞增殖速度減慢，×200

圖1E、F 細胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細胞發出綠色熒光×400

2.2 生長曲線 第2日開始進入對數生長期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2 傳代MDSCs的生長曲線

2.3 對PP6的細胞表型鑒定 肌源性干細胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結蛋白(desmin) 可通過細胞免疫熒光方法鑒定。本實驗采用小鼠抗大鼠desmin一抗對肌源性干細胞進行鑒定，細胞質desmin染色陽性（圖1E，1F），細胞胞質呈現綠色熒光。觀察500個細胞，90%為desmin陽性。

3 討

論

近年在骨骼肌中發現了一群被稱為MDSCs的細胞群體。預期它們在組織工程應用領域特別是細胞移植和基因治療方面前景廣闊。國外已在進行大量MDSCs介導的相關的基因治療和組織工程的動物實驗［6-8］，并取得了較明顯的效果。因此建立和完善MDSCs培養方法，獲取高純度的細胞具有重要實用價值。

骨骼肌細胞是由胚胎的生肌節和各處的間充質細胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平成立方形細胞，稱為衛星細胞［9］，是保留在成年骨骼肌內具有增殖分化能力的單潛能成肌干細胞，這種組織特異性的干細胞在出生后骨骼肌的損傷、修復和維持中起重要作用。有證據表明新近發現的肌源性干細胞(MDSCs)是一群與衛星細胞完全不同的細胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干細胞。

lee等［7］31-37從骨骼肌細胞中發現了MDSCs，與衛星細胞相比，其具有更多的分化潛能，不僅能分化成骨骼肌纖維，促進肌組織再生，還能分化成成骨細胞，促進骨骼愈合［5］，被認為是衛星細胞的前體。貼壁前的MDSCs呈小而圓的球形，折光性強，剛貼壁仍為圓形，貼壁后的MDSCs呈紡錘形，延遲分瓶時會融合成成熟的多核肌管，這與成纖維細胞不同。preplate技術利用差速貼壁獲取MDSCs，其原理是成纖維細胞、內皮細胞的貼壁能力強于衛星細胞，衛星細胞的貼附能力又強于MDSCs，4 d內即可完全貼壁而此時MDSCs仍處于懸浮狀態［6］1085-1100，實驗中發現，組織塊中加入膠原酶后很快就變成了乳糜狀，胰酶對組織具有很好的離散作用，再通過反復吹打可將細胞從基膜中分離出來，得到的細胞為成纖維細胞、白細胞、內皮細胞、衛星細胞及MDSCs的混合物，利用差速貼壁法4 d后處于懸浮狀態的細胞移出培養即為純化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我們通過結蛋白desmin染色鑒定其肌源性，通過其多向分化的能力來鑒定其干細胞特性。實驗中我們還發現，隨著乳鼠出生天數的延長，所取得的MDSCs的數量和活力逐漸下降，但出生時間太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最適宜進行原代取材。

結蛋白（desmin）是中間絲蛋白的一種，是成肌分化的早期的標志，常作為肌源性的標志，雖然成纖維細胞與骨骼肌內血管平滑肌細胞也產生結蛋白，但此細胞中結蛋白含量低，與抗體產生弱陽性反應，且僅有15％的desmin陽性率［10］，而通過本方法獲取的MDSCs中desmin陽性率高達90%，由此可進行初步鑒別。

MDSCs屬于成體干細胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活時間長等優點，在組織工程和基因治療中具有廣泛的應用前景。通過對常規技術的改良，本研究建立了一種穩定高效的新生大鼠MDSCs分離純化技術，并成功對MDSCs進行了鑒定，為MDSCs在基因治療和組織工程的臨床應用打下了基礎。

參考文獻

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篇（2）

自lichter等[1]1981年首次報道了甘藍型油菜游離小孢子培養并成功獲得了再生苗,在后來的20多年里,國內外學者已經成功地在甘藍型油菜中建立了小孢子培養技術體系,特別是用此種方法從培育的dh群體中獲得的多種油菜品種已經在生產中得到了廣泛的認可。現將甘藍型油菜小孢子加倍培養技術介紹如下。

1選取花蕾

一般在天氣晴朗的8~10時取材,如遇陰雨天氣,為了不影響試驗進程也可取材,但一定要選取生長良好的花序,研究報道低溫有利于小孢子的胚胎發生。盡量選取主花序或生長狀態較好的花序,然后在實驗室選取大小在2.5~3.5mm的花蕾備用。不同的材料花蕾的發育時期不盡相同,可以剝蕾挑取小孢子進行鏡檢以確定發育時期,最佳時期為單核晚期至二核期。花藥為淡綠色呈透明狀。取蕾以后如果不能立刻進行小孢子的提取,應將花蕾放置于濕潤的條件下低溫保存。

2游離小孢子分離

先用75%的醫用酒精將花蕾表面滅菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用無菌水沖漂洗3次,每次5min。將消毒的花蕾置于滅過菌的玻璃管中,加約2ml b5提取液,用滅菌玻璃棒將花蕾研碎,壓出花粉小孢子,通過2層槽式無菌濾紙,或45μm的尼龍網,或0.22μm孔徑的微孔濾膜過濾,把濾液倒入滅菌了的帶蓋的10ml離心管里,用滴管吸b5抽提培養液沖洗過濾器中的花粉,沖2~3次后,在10ml離心管中將花粉懸浮液稀釋;將花粉懸浮液離心,800rpm,離心5min;將離心管中的上層清液吸去,再加液體b5抽提液,并將沉淀的花粉用吸管沖散,再次懸浮離心(用封口膜封口),1 800rpm,離心5min,吸去上層清液。

3小孢子加倍培養

將沉淀的花粉用nln-16 液體培養基稀釋,稀釋不要超過10ml,因為加倍后還要在10ml的離心管中再次稀釋離心,倒入三角瓶在32℃條件下暗培養2d左右(48~72h);然后檢查是否有污染,如果沒有污染,則分皿繼續培養。

4胚誘導培養

將加倍后的nln-16花粉懸浮液倒入離心管離心,800rpm,離心5min,倒掉nln-16液體;將沉淀的花粉用nln-13培養液稀釋,稀釋后的懸浮液分裝入7.5cm培養皿,一般每皿加入懸浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0個/ml,小孢子密度為10~50萬個/ml,用封口膜封口;將封口的培養皿在25℃的條件下進行暗培養,10d左右開始查看是否有可見的顆粒狀胚,如果沒有則繼續培養[2]。

5胚狀體培養

當肉眼可見的小胚狀體出現時,把培養皿放在搖床上振蕩暗培養5~7d,轉速為80～100rpm。然后將魚雷形、子葉形胚狀體移植到b5固體培養基上,在25℃光暗交替條件下持續培養,誘導植株再生[3]。

6再生苗培養

培養1~2周后,見到子葉長大變綠,胚根伸長,長滿白色根毛。繼續培養后形成真葉,胚根不再伸長。當達到3～4片真葉時,再轉移到生根培養基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培養基上進行扦插繁殖,獲得完整植株。

7再生植株倍性鑒定

對再生植株進行細胞學鑒定(染色體數目)或在開花以后根據花器形態(雄蕊和花瓣形態)進行鑒定[4-7]。若是單倍體植株,需要再加倍培養成雙倍體,可以把帶有秋水仙堿溶液的脫脂棉蓋在植株的頂芽、腋芽上;或者初花期把單倍體植株從土壤中取出,洗凈根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙堿溶液泡1.5～8.0h,再移栽田間;或者胚狀體再生獲得的試管苗,在含10～100mg/l秋水仙堿的b5液體培養基中無菌培養4～8d,轉到無秋水仙堿的b5培養基中培養7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。

8參考文獻

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篇（3）

1胞外生物支架材料的應用

研究者對各種胞外支架材料進行了研究，包括聚乙烯樹脂、海藻酸鹽、聚氨酯泡沫等，都是具有親水多孔性結構的天然或人工合成的有機大分子。在一定的培養條件下，肝細胞在基質孔隙中重組形成許多有功能的聚集體，這些聚集體中可能具有接近的細胞-細胞接觸，且形成類似于體內組織的結構，因而表現出比早先單層貼壁培養的肝細胞更好的生理功能。

1.1海藻酸鹽(alginate)海藻酸鹽是目前常用的促進肝細胞聚集的物質，藻酸鹽海綿體具有高度多孔的結構，孔徑在100～150 μm，由于藻酸鹽是親水性物質，所以肝細胞能容易地進入基質內部。Glicklis［1］等以藻酸鹽海綿體為支持基質培養肝細胞。DNA測定表明最初兩周肝細胞的數量并不增加，MTT測定顯示絕大多數細胞保持活力。接種24 h內在藻酸鹽海綿狀結構內觀察到活細胞聚集體，這種聚集體在培養的第四天平均直徑100 μm，與基質孔徑同一數量級。聚集體的三維結構促進了細胞功能的表達：1周內達最大白蛋白分泌量。微囊化肝細胞培養利用半透膜將肝細胞包在囊內(囊壁分子量截率

1.2聚氨酯泡沫(Polyurethane foam，PUF)聚氨酯泡沫是另一種高度多孔性的過濾材料。日本Gion等［3］以PUF為材料設計出一種填充床式生物反應器，以該反應器為基礎組成的混合型生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL），在狗肝衰竭模型中，可顯著降低血氨和血清肌酐，升高血糖和血壓。Pahernik等［4］研究了以PUF材料進行豬肝細胞高密度培養的可行性，作者認為PUF是一種生物相容性較好的材料，適于肝細胞的高密度培養。Kurosawa等［5］采用聚氨酯膜(Polyurethane membrane，PΜM)作為肝細胞培養支持物，構建固定床(fixedbed)生物反應器并用于大鼠肝細胞的高密度培養。PΜM孔徑從上層到下層逐漸遞減，肝細胞懸液流經PΜM時，5 min內黏附的肝細胞密度可達2～3×107/cm3PΜM，黏附效率高達99%；黏附肝細胞以輕度聚集的球形體形式存在，白蛋白分泌持續時間比單層培養長。

1.3微載體(microcarrier)微載體目前經常用于生物型人工肝的肝細胞培養，可以大大提高生物反應器內肝細胞的培養密度。微載體細胞培養技術可以形成以微載體為核心的肝細胞聚合球，細胞濃度可達107 cell/ml，使肝細胞不貼壁而呈懸浮狀培養，更接近于正常的生理狀態。Wermer等［6］用不同密度的永生化人肝細胞與不同濃度的明膠微載體進行旋轉培養7 d后，2×105 cell/ml與1 g/L微載體組獲得的細胞濃度為4.5×106 cell /ml；5×105 cell/ml與3 g/L微載體組細胞濃度為7.1×106 cell/ml。微載體上沾滿細胞，呈球形狀態。肝細胞24 h可產生5 ng/ml乙基甘油二甲基苯胺(EMGX)，而用50 ng/ml苯巴比妥誘導3 d后，則產生26 ng/ml的MEGX，顯示了肝細胞代謝的潛能。目前，微載體培養是動物細胞大規模高密度培養中技術相對完善及有實用價值的一種培養模式，并且已有多種商品化的微載體可供選擇。

1.4中空纖維(hollow fiber)中空纖維是人工合成的高分子材料半透膜，纖維內腔直徑約200 μm。將數百或數千束纖維裝在容器中，即中空纖維艙，最常用于構建生物型人工肝生物反應器。Liu等［7］對體外中空纖維肝輔助裝置中的永生化豬肝細胞進行了研究，發現細胞接種后增殖迅速，在培養的25 d期間，肝細胞保持著對安定及撲熱息痛的代謝活性。超微結構檢查可見形成膽小管結構的橋粒及連接復合體。Sosef［8］等將豬的自體肝細胞置于中空纖維倉，培養24 h后治療豬急性肝功能衰竭（FHF）模型，明顯延長存活時間，降低血氨水平。在多種材料結合的基礎上，研究者提出并嘗試了多種有應用價值的肝細胞培養系統。Arnaout［9］等在中空纖維外腔植入微載體培養的肝細胞構建生物型人工肝，對FHF和慢性先天性代謝性肝病動物模型均有肝輔助作用。Nyberg［10］等在中空纖維內腔內種植膠原凝膠包埋肝細胞，培養液在膠原外纖維內循環，形成肝細胞培養的三維框架，患者血漿在纖維外灌流，體外實驗證明此系統具有合成蛋白功能及藥物代謝功能，動物實驗能改善FHF動物模型肝功能指標，但未見進一步的臨床應用報道。Dixit［11］將兩種不同的中空纖維管置于同一外殼內，其中一種通過培養液，纖維外部附肝細胞; 另一纖維管循環宿主血液/血漿。體外實驗研究表明這種肝細胞反應器可提供特異性的肝細胞功能。Gerlach［12］等將細胞培養于三維網狀交叉的中空纖維之間，實驗表明可使肝細胞高密度培養，肝細胞功能維持可達5周。Funatu K［13］等用聚氨酯泡沫(polgurethanefoam，PUF)在離心條件下中空纖維內培養肝細胞，3 d內形成表面光滑的柱型組織化結構(Organoid)，維持肝功能達4個月以上，Nakazawa［14］應用此種生物反應器治療FHF豬動物模型可改善其生化指標，提高生存率。

1.5其他Tobe S［15］等報道大鼠的肝細胞能夠附著著在一種缺乏唾液酸蛋白的聚DP芐乙烯D乳酰氨(polyNpvinylbenzylDlactonamide，PVLA)上形成錨定的多層聚集體，在培養液中加入EGF和胰島素時形成穩定的三維結構。這種聚集體中的肝細胞有很高的白蛋白分泌能力，作者推測可能是多層聚集體中的細胞通過聚集體的形成而穩定地分化所致。Ohshima等［16］將聚乙烯樹脂(Polyvinyl formal，PVF)置于一圓柱形容器內組成一種填充床式生物反應裝置，適于肝細胞的培養密度可達107 cell/cm3，且培養肝細胞具有良好的氨代謝、尿素合成及分泌白蛋白等功能；掃描電鏡觀察顯示，肝細胞在形態及排列等方面均優于單層培養。

2模擬微重力培養

模擬微重力肝細胞培養是利用旋轉式生物反應器，提供一個模擬微重力的條件，反應器內培養的細胞呈一種失重狀態，可自發形成組織樣結構。研究者們在一系列的細胞三維培養研究中先后取得重要進展表明，利用回轉生物反應器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)模擬微重力培養環境，可以顯著改善離體細胞的生長狀況，使在普通培養條件下只能二維貼壁生長的動物細胞表現出三維增殖與分化。Rise k等［17］等利用模擬微重力培養環境共培養純化的肝細胞與膽管上皮細胞，發現肝細胞與膽管上皮細胞自發聚集于聚合物支架上，生長達2個月，在三維結構上肝組織內有肝索、膽管以及管狀內皮結構形成。國內張鈺鵬［17］也在模擬微重力條件下進行大鼠原代肝細胞微載體培養，多個微載體表面的肝細胞可連接成團，形成“肝細胞微載體聚球體”的基本結構模式。透射電鏡下，肝細胞在不同部位顯現不同的膜結構：與培養液接觸的表面出現許多不規整的微絨毛，類似體內的肝竇面。肝細胞之間則胞膜平直，膜間縫隙狹窄，類似體內的肝細胞間接觸面。

篇（4）

Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI

【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hepatoma cell line (HepG2)，hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS)， so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS: The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption， SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2， HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines， in the segments from Mr 5000 to 15 000， proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes， in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells， the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience， high sensitivity， and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found have a potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins， as well as the searching of new therapeutic target sites.

【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells， cultured; distinct protein

【摘要】 目的： 運用表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質譜(SELDITOFMS) 技術，檢測體外培養的肝癌細胞株（HepG2），轉染乙肝病毒的肝癌細胞株（HepG2.2.15）與正常肝細胞株（LO2）蛋白質的差異表達，篩選肝細胞癌的標志蛋白，為進一步研究肝癌發病的蛋白質組學機制奠定基礎. 方法： 常規培養上述3種細胞，細胞狀態良好時收集細胞，裂解細胞后采用 SELDITOFMS技術用WCX2芯片檢測HepG2， HepG2.2.15， LO2細胞內蛋白質組學的差異表達. 結果： WCX2芯片共捕獲91個蛋白，在Mr 5000~15 000區段，與正常肝細胞株比較，有7個蛋白質在兩種肝癌細胞中出現明顯變化，其中2個蛋白在肝癌細胞中表達量增高，5個蛋白在肝癌細胞中表達量降低；另外兩種肝癌細胞株也有其各自的標志蛋白，9個蛋白分子在HepG2表達量增高，10個蛋白分子在HepG2.2.15表達量增高. 結論： SELDI蛋白芯片技術檢測可作為檢測肝癌早期生物標記的方法，它簡便，敏感性高，重復性好，本文發現的這些組織特異性蛋白生物標記對肝癌的早期診斷有潛在的應用價值，對我們從血清或組織標本中篩選和鑒定不同型別肝癌細胞之間的標志蛋白有重要意義，從而為從蛋白質水平研究肝癌的發病機制及新的治療靶位的尋找奠定了一定的基礎.

【關鍵詞】 表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質譜；蛋白質陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細胞，培養的；差異蛋白

0引言

原發性肝癌(HCC)在我國是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在部分城市中占惡性腫瘤死因的第二位. 每年有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數的45%. 肝癌早期沒有明顯體征，多數病人確診時已屬晚期，難以治愈，死亡率很高. 所以，對于肝癌的早期診斷，在無癥狀的人群中發現早期病例，對控制肝癌的病死率有現實的意義. 因此，研究并尋找有價值的預警肝癌的標志物，成為進一步提高肝癌臨床治療水平的關鍵. 任何疾病在出現病理變化之前，細胞內的蛋白質在成分和數量上都會有相應的改變，癌癥的發生是一個多基因多階段多因子的動力學過程，HCC也不例外，目前對肝癌發生機制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表達的蛋白質水平，因此，要求對生物功能的執行者蛋白質進行研究.

蛋白質組是指一個基因組、一個細胞或組織或一種生物體所表達的全部蛋白質［1］. 蛋白質組學（Proteomics）是蛋白質組概念的延伸，是在整體水平上研究細胞內蛋白質組成及其活動規律的學科. 蛋白質組學技術為研究腫瘤標志物與腫瘤進展轉移研究提供良好的技術平臺， 為研究開辟了新的手段和視角. SELDI蛋白質芯片技術是近年來新興的一種蛋白質組學技術，它具有簡單、快捷、靈敏等特點，可以檢測分子量在Mr 500~500 000之間的蛋白或多肽，而且所需樣本體積小（0.5~400 μL）［2-3］. 我們應用細胞裂解液裂解體外培養的3種細胞（LO2， HepG2， HepG2.2.15），進行了表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質譜技術（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝細胞、肝癌細胞與轉染乙肝病毒的肝癌細胞的蛋白表達圖譜［4］，發現了一系列（信噪比）差異表達的蛋白，為今后從血清或肝癌組織中篩選標志蛋白提供科學依據.

1材料與方法

1.1材料正常肝細胞株（LO2）購自中科院上海細胞庫；肝癌細胞株（HepG2）及攜帶乙肝病毒的肝癌細胞株（HepG2.2.15）由第四軍醫大學吳力克主任醫師贈送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），TritonX100，尿素，4羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性劑（CHAPS）均購自美國Sigma公司，蛋白質芯片時間質譜分析儀（PBSⅡC）及WCX2（弱陽離子交換芯片）購自美國Ciphergen Biosystems公司.

1.2方法

1.2.1細胞總蛋白質的提取LO2， HepG2細胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培養基培養，HepG2.2.15細胞另外加入終濃度200 g/L的G418，細胞長成單層后，用無菌細胞刮刀刮取細胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea， 40 g/L CHAPS， 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 μL， 4℃劇烈震蕩30 min， 20 817 g離心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系統測定蛋白濃度，用裂解液調節至所有樣品濃度為2 g/L，其余上清分裝-86℃備用. 每種細胞收獲3次，以排除組間差別. 每份樣品至少在2個以上的同種芯片上檢測，以排除不同芯片間的差異.

1.2.2WCX2蛋白芯片操作步驟將芯片裝入蛋白工作平臺，每孔加入200 μL結合/洗脫緩沖液（50 mmol/L NaAc， pH 4.0）預處理芯片，室溫下200 r/min振蕩5 min，棄緩沖液，重復上述操作1次. 每孔加入50 μL 1∶2稀釋的樣品，劇烈震蕩，室溫孵育1 h. 棄掉樣品，每孔用200 μL結合/洗滌緩沖液洗滌2次，每次震蕩5 min. 棄去孔中液體，每孔加入200 μL HPLC 水，立刻甩出. 從蛋白工作平臺中取出芯片，空氣中干燥，每孔加入0.5 μL EAM（SPA中加入75 μL乙氰和75 μL 10 mL/L三氟乙酸）重復1次. 干燥后用蛋白質芯片閱讀機進行質譜分析.

1.2.3數據采集和結果分析用加有Allinone標準分子量蛋白的NP20芯片校正質譜儀，儀器參數設置如下： 激光強度220，檢測敏感度10，優化分子質量范圍為Mr 2000~10 000，最高分子量為Mr 50 000，采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析軟件自動采集數據，然后用Biomarker Wizard 軟件分析LO2， HepG2， HepG2.2.15細胞的蛋白質譜差異.

2結果

2.1重復性試驗為了保證試驗結果的可靠性，我們首先進行細胞計數為1010/L，樣品蛋白濃度為2 g/L以減少細胞本身蛋白的差異；同時每種細胞收獲3次，以排除組間差別；每份樣品至少在同種芯片3個以上不同點進行檢測，以排除不同芯片點之間的差異. 然后用SELDITOFMS對樣品孔進行測定，經質譜分析后選擇了8個蛋白峰，測變異系數，結果顯示其M/Z及強度的CV分別為1%， 5%，分析結果表明試驗重復性好，結果可靠.

2.2差異蛋白的比較

2.2.1LO2， HepG2， HepG2.2.15三者比較明顯差異蛋白峰共7個，其中Mr 7945， 7979在肝癌細胞中表達增高， 5818， 8428， 10 106， 10 312， 11 084在肝癌細胞中表達降低（圖1）.

2.2.2肝癌細胞和轉染乙肝病毒的肝癌細胞蛋白質表達差異HepG2， HepG2.2.15細胞差異蛋白峰共19個， 9個蛋白峰在肝癌細胞中表達增高，10個蛋白峰在肝癌細胞中表達降低（圖2）.

2.2.3差異蛋白質的初步鑒定將發現的差異蛋白峰在Swiss蛋白數據庫中搜索（us.expasy.org/tools/tagident.html），發現Mr 11 084.0蛋白峰與鈣結合蛋白S100 A10相符. 其他幾種蛋白暫時尋找不到.

A： LO2細胞；B： HepG2.2.15細胞；C： HepG2細胞. 上部分為蛋白峰表達情況: 橫坐標表示相對分子量，縱坐標表示蛋白質峰的強度；Mr 11 084.6， 10 106.4蛋白在LO2中表達最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分為蛋白質圖譜的模擬凝膠圖： Mr 11 084.6， 10 106.4兩條帶是LO2， HepG2.2.15和HepG2細胞的差異蛋白.

圖13種細胞在Mr 10 000~11 500區段的蛋白質檢測結果（略）

A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 橫坐標表示相對分子量，縱坐標表示蛋白質峰的強度. Mr 10 106.4， 11 084.0， 11 658.4蛋白在HepG2中高表達，在HepG2.2.15中低表達.

圖2HepG2， HepG2.2.15細胞在Mr 10 000~12 000區段的蛋白質檢測結果（略）

3討論

腫瘤早期就可在蛋白質水平出現細微但重要的組合改變［5］，近來研究表明，腫瘤性疾病從蛋白質組學的角度又可以被認為是一種蛋白質缺陷病，其發生過程中有多種蛋白會發生異常變化. 從組織增生產生原位癌到產生癌變的過程中，有不同的功能性蛋白的參與；轉移也是多步驟復雜連續的過程， 與轉移有關的特殊基因受到激活并有多種水解酶的參與. 總之， 腫瘤在發生發展轉移的過程中， 在分子水平有不同的功能性蛋白參與， 并且功能性蛋白很可能在各個環節相互協調共同表達. 蛋白表達異常不僅包括蛋白表達量的增加或減少，還包括蛋白翻譯后加工上的改變，從而導致腫瘤組織表達的蛋白質譜(protein profile) 的改變. 因此利用蛋白質組學方法檢測蛋白質譜的變化可以更加準確地診斷腫瘤及了解腫瘤的發病機制.

臨床上現有的HCC標志物眾多，但尚無單一標志物能夠診斷所有HCC. 這就需要探索一種新的技術以發現早期腫瘤標志物. SELDI蛋白質芯片技術可檢測疾病進展中不同階段血清中多肽量的變化，翻譯后修飾的改變或某些多肽的聚糖結構變化，為HCC腫瘤標志物的進展提供了一個新的方法，它靈敏度高、特異性好、重復性強、操作簡單且微量化［6］，可同時檢測血清中的多種蛋白質已被應用于檢測多種生物學樣品.

體外培養的細胞株雖然不能完全反映體內細胞的生長狀態和生物學活性，但它具有成分單一、均質性好、實驗條件容易控制等優點. 尤其在做對比性研究時可避免由組織細胞成分復雜，細胞異質性高等缺點造成的結果不真實和不可靠［7］. 我們培養了LO2， HepG2和HepG2.2.15細胞，裂解細胞蛋白定量后SELDITOFMS分析蛋白表達的差異. WCX2芯片，用于分析正電荷蛋白，弱陽離子碳化合物構成活性位點，與樣品中賴、精或組氨酸反應，它捕獲的蛋白pI一般大于4. 我們在分子量Mr 3000~30 000范圍內，共捕獲91個蛋白峰. 其中肝癌細胞株與正常肝細胞株差異蛋白共7個，不同亞型肝癌細胞與正常肝細胞比較有共同的差異蛋白，說明在肝癌的發生或發展過程中涉及到一些共同的蛋白質改變；我們對不同類型的肝癌細胞株差異蛋白質進行分析，結果HepG2， HepG2.2.15細胞差異蛋白峰共19個，表明不同肝癌細胞株也具有特異的差異蛋白，這對我們從血清或組織標本中篩選和鑒定不同型別肝癌細胞之間的標志蛋白有重要意義.

這些組織特異性蛋白生物標記對我們從血清或組織標本中篩選或鑒定標志蛋白有重要意義，對肝癌的早期診斷有潛在的應用價值，更主要的是為研究肝細胞癌變機制提供了一個基礎，而且這些蛋白有可能為肝癌治療提供新的靶位，可以進行RNA干擾來阻斷其高表達或通過基因導入來促進低表達蛋白的表達.

用Swiss蛋白數據庫中檢索分子量和pI值匹配的蛋白質發現Mr 11 084蛋白峰可能為鈣結合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一個有21個成員的鈣結合蛋白家族， S100蛋白通過對鈣離子的調節及與靶蛋白的相互作用，在體內發揮多種生物學功能. 研究發現 S100家族與腫瘤的發生發展關系密切，它們參與細胞周期調控，在多種腫瘤中表達異常，并與腫瘤的浸潤、轉移有關. S100 A10在腫瘤發生中的作用還不確定，它可能與Annexin II（p36）組成復合物，抑制p36磷酸化，參與細胞周期調控［8］. 在肝癌的發生中S100 A10可能通過p36起作用，它在肝癌細胞 HEPG2中低表達，抑制p36磷酸化的作用降低，從而抑制細胞增殖的作用降低，可能引起細胞生長失控而致癌.

從理論上講，肝癌在發生、發展過程中其細胞內的蛋白質變化可以反應到血清中，可從體外培養的肝癌細胞株中篩選出部分與癌病人血清相一致的標志蛋白，有些改變可能只存在于細胞內而不分泌或代謝到細胞外，這部分蛋白可能是與癌癥的發病密切相關的功能蛋白和調節蛋白.

目前，我們正進一步研究HBV感染攜帶者與HCC患者及正常人血清蛋白質的差異表達，結合體外培養細胞株的研究通過對比分析進一步篩選差異蛋白，下一步我們將蛋白純化后進行序列測定，應用串聯質譜分析鑒定特定的蛋白，以期確認肝癌的標志蛋白和功能蛋白，為臨床肝癌的診斷提供新的思路，以期使肝癌的血清學診斷成為可能.

參考文獻

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篇（5）

一、MDCK 細胞大規模培養技術

細胞的懸浮培養可謂是理想的大規模細胞培養方式，懸浮培養技術是在生物反應器中，在人工條件下，高效率大規模的培養動物細胞進而應用于生物制品生產的技術，可根據細胞的貼壁能力分為微載體懸浮培養方式和全懸浮培養方式。

1. 微載體懸浮培養。MDCK 細胞是從犬腎分離出來的一種貼壁依賴性上皮細胞，且它具有典型的“失巢凋亡”現象，即一種特殊的細胞程序死亡，是由于細胞與細胞外基質或相鄰細胞脫離接觸而誘發的，也就是說依靠傳統的馴化方式或者單純的用機械攪拌使MDCK 細胞懸浮生長難度相當大。Van Wezel 創立的微載體懸浮培養系統開創了細胞體外大規模培養的先河，更為準確的說是使貼壁細胞大規模培養成為現實。微載體懸浮培養是一種先進的貼壁細胞培養技術，其原理是將對細胞無害的顆粒加入到生物反應器的培養液中，作為載體，使細胞能在微載體表面附著生長，同時加以持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。反應器中使用微載體是一種可以提高細胞濃度的策略，其細胞密度可達1×107 cells/ml。

采用微載體培養MDCK 細胞，結合了懸浮培養與貼壁培養的優點，包括（1）細胞貼壁表面積大大增加，培養基利用充分，細胞密度增大。（2）微載體可在攪拌停止時沉降，便于將培養基與細胞分離。（3）與方瓶貼壁培養時的代謝變化不大，正常培養基可通用等等。

但是，目前生物反應器微載體培養研究只是單批次的培養，其消化放大培養依舊是難題。且微載體培養過程中一般添加了血清，給下游純化帶來了巨大壓力。采用商業無血清培養基，會大大增加企業生產成本。因此，自主開發無血清培養基進行MDCK 細胞懸浮培養是目前的發展趨勢。

2. 無血清單細胞懸浮培養。我們知道，生物制品生產尤其是細胞培養方法生產病毒疫苗的過程十分嚴謹。細胞培養需添加血清，可是血清的加入無疑給生產后期的除雜純化等工藝帶來難度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1 和HA2，能夠介導病毒囊膜和靶細胞膜結合，病毒開始繁殖，而MDCK 細胞本身不具備裂解HA 的蛋白酶類，所以常常添加胰蛋白酶來提高病毒產量，但是，細胞培養中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，這種矛盾致使MDCK 無血清培養問題更亟需解決。目前，MDCK 無血清培養已經取得了很大的進展，基本思路是在基礎培養基的基礎上補加各種生物活性因子來替代血清，結合細胞生長所需成分，配制出無血清培養基， 能夠支持MDCK 細胞正常生長增殖。一般常見的營養添加因子有：胰島素，人轉鐵蛋白，氫化可的松等等，再經過對這些添加因子的添加量的優化，最終確定無血清培養基成分。

現在，已有MDCK 細胞商業用無血清培養基，它們的成功問世解決了這一大難題。通過直接法或間接法，即：原含血清培養貼壁細胞直接消化傳代換成無血清培養基培養或逐步降低血清濃度直至降到無血清培養，使MDCK 細胞適應無血清培養基，生長狀態優良且能正常增殖傳代。

完成了MDCK 無血清培養后，MDCK 單細胞懸浮培養仍在研究當中，有文獻報道，已有馴化成功的MDCK 懸浮細胞系，但就市場應用來看，是遠遠不夠成熟的。現階段，馴化MDCK 細胞在適應了無血清培養基培養的基礎上，對其進行單細胞懸浮培養馴化方法主要有以下幾種：（1）使用硅化方瓶培養：將細胞培養方瓶先用硅化劑處理，防止了細胞的貼壁，再通過調整培養基成分，使細胞增殖；（2）使用搖床或搖瓶體系，通過外力作用，防止細胞貼壁，再對細胞進行篩選，然后擴大培養。

二、 MDCK 細胞應用于流感病毒疫苗生產

采用細胞系培養流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生產方法，市場銷售的一些貼壁細胞系如Vero 細胞，MDCK 細胞是應用于流感疫苗研究最典型的哺乳動物細胞系，經研究，這些宿主細胞產生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，從相應的細胞培養生產的疫苗免疫應答效果和用雞胚生產的疫苗一樣好。MDCK 細胞應用于流感疫苗生產有很多優點：MDCK細胞易培養、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效擴增流感病毒；MDCK 細胞生產的疫苗可以應用于對雞胚蛋白過敏的患者等等。在使用MDCK 貼壁細胞接流感病毒后，通常會有較高的細胞特異性產率；微載體懸浮培養的MDCK細胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高達9log2（1∶512）；就已知實驗室用馴化出MDCK 懸浮細胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于貼壁細胞系。且已有疫苗廠商如Solvay 制藥公司采用無血清培養基、微載體技術制備出了MDCK細胞流感亞單位疫苗；諾華公司制備出了由MDCK 細胞培養生產的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在過去十幾年中，用動物細胞培養制備流感疫苗生產方式已經替代了傳統的使用雞胚生產方式。動物細胞培養生產流感疫苗的特征在于其靈活性和可擴展性，然而，貼壁細胞易培養但是卻很難擴大生產量，而如果使用微載體提供生長表面又會大大增加其成本。所以要努力創建懸浮細胞系，特別是MDCK懸浮細胞系。

多年以來，監管部門督促行業設立無血清培養流程，以避免污染。

然而，許多市售培養基仍然需要添加物，以達到高細胞密度和最大產物產量。理想的情況是，在疫苗生產中應該使用不需添加另外的蛋白質等混合物的已知成分的培養基。這不僅會降低批次變化的風險也有利于病毒收獲的下游處理。此外，疫苗生產過程可以被簡化，可以直接接毒而不用更換培養基。

篇（6）

【中圖分類號】R372 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004―7484（2013）09―0118―01

2009年5月，新甲型H1N1病毒造成世界范圍內的大流行，2013年春季在中國長三角地區流行甲型H7N9流感病毒，加強對流感病毒監測對于疫情分析、流行趨勢研判、疫苗研制等方面有著極其重要的意義。目前國內在流感病毒監測方面主要采用核酸檢測和單層貼壁細胞培養技術。由于標本采集的問題及細胞在體外環境下生長逐漸喪失了原有的性狀[1]，在很多情況下，所取到的研究結果和實際結果不符合。傳統單層細胞培養得率過低是大量病毒監測工作中難以突破的的瓶頸。我們建立了三維細胞培養技術方法在流感病毒的網絡監測中得到較好的應用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集：上海市黃浦區流感網絡監測定點醫院（第二人民醫院）流感監測點于2013年1-2月冬春季采集的類流感病例鼻咽拭子合計76份。

1.2 核酸抽提：取鼻咽拭子病毒采樣液140微升，使用QIACUBE?核酸抽提儀，試劑使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit（250）試劑盒提取病毒RNA。

1.3 流感病毒核酸檢測：Real-Time RT- PCR檢測使用上海之江生物技術有限公司甲型流感病毒核酸檢測試劑盒（A型/B型流感核酸檢測試劑盒、H1、H3、H1N1（2009pdm）型核酸檢測試劑盒），PCR擴增儀使用國產上海宏石SLAN熒光定量PCR擴增儀。反應條件如下：45 ℃ 10 min逆轉錄，95 ℃ 15 min變性，95 ℃ 15s，60℃ 1min FAM通道檢測熒光，40個循環。

1.4三維細胞培養

1.4.1培養儀：采用Hamilton?公司的BioLevitator?三維細胞培養儀。

1.4.2細胞來源：75mL細胞培養瓶復蘇的狗腎細胞（MDCK），消化后得到懸浮細胞。將懸浮細胞接種到GEM微載體上，在培養設備上運行接種程序。當細胞生長覆蓋率達到80%以上時，加入兩倍量的新的GEM微載體。繼續培養，在培養過程中根據需要更換新的培養基。當細胞生長覆蓋率達到80%以上時，將培養管內溶液分裝到三個新的培養管中。向三管中分別加入兩倍于原體積的新培養基和兩倍于原數量的GEM微載體。在培養設備上運行接種程序。

1.4.3細胞生長：當細胞生長覆蓋率達到80%以上時，取出培養管，用磁鐵吸住GEM微載體，移去培養基。用3-Dissolution試劑將GEM微載體溶解，用磁鐵吸去磁性顆粒，得到細胞。轉移細胞溶液至新的50mL管中，將細胞清洗、懸浮后細胞分裝并計數。細胞樣品可以用于下游的檢測或其它應用。

1.4.4接種病毒

1.4.4.1接種中毒：當細胞生長覆蓋率達到要求后，開始進行病毒感染實驗。采用上述9份季節性流感病毒H3核酸檢測陽性標本分A、B組進行染毒試驗。A組為貼壁細胞培養的細胞，B組為三維細胞培養的細胞。置37?C， 7.5% CO2濃度培養，每天觀察，當有90%的細胞出現CPE后，進行收毒。

1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入離心管，在1，000-2，000轉下離心10mins，以此除去細胞碎片，將離心后的上清夜轉移，棄底部沉淀，該上清液進行病毒滴度測定。

1.4.5 三維細胞培養細胞的觀察與計數

1.4.5.1取50μL培養液（cells on GEM?）至96孔板中的一個孔內。加入100μL Hoechst 33342溶液到該孔內。室溫下放置15-20分鐘。用顯微鏡在紫外和DAPI濾光片下觀察。

1.4.5.2細胞計數用CubeMagnet將剩余的400μL細胞樣品中的生長在GEM上的細胞吸附到底部。用移液器將培養基移除。加入1mL PBS到樣品中。在CubeMagnet幫助下，移除PBS緩沖液。加入200μL 3-Dissolution到樣品中。37?C孵育10-15分鐘，用顯微鏡觀察直到GEM被完全溶解。將蓋玻片平鋪在血細胞計數器上。加入50μL Trypan Blue和50μL細胞樣品到微離心管中。蓋上蓋子混勻。取10μL細胞/Trypan Blue混合物到蓋玻片下面。用血細胞計數器對活/死細胞進行計數。

1.5 MDCK單層細胞培養：參照中國國家流感中心實驗室流感病毒監測方案操作方法。[2]

1.6 血凝試驗方法：參照中國國家流感中心實驗室流感病毒監測方案操作方法。[2]

1.7 結果的統計與分析使用統計學軟件stata 7.0。

2 結果

2.1 標本直接核酸檢測結果：經RT-PCR篩查甲型流感核酸陽性標本9份，陽性率為11.8%（9/76）。其中H3分型陽性6例，未分型（包含H1、H3、H1N1（2009pdm））共3例。CT值分別為29.2，31.2，32.1，33.2，35.2，37.5 。

2.2細胞生長效率比較：75mL細胞瓶狗腎細胞（MDCK）工作容量為10mL，細胞總數為2*106個。傳統貼壁細胞培養傳代一次可以得到9瓶25mL細胞瓶的狗腎細胞用于病毒培養，其工作容量約為18毫升單位細胞數2.5*105個/mL，得到的細胞總數約為4.5*106個。利用三維細胞培養技術計數培養后可以得到4瓶40mL細胞懸液。用細胞計數板5次，結果見表一。 計算公式：總細胞數=單格細胞計數*104*160/ml。

2.3 接種中毒后血凝效價比較：用9份甲型流感病毒病毒核酸陽性標本，采樣液染毒后血凝效價測定結果見表二，A組為單層細胞貼壁培養中毒，B組為三維細胞培養后中毒實驗。

以上結果用幾何均數配對T檢驗統計分析，結果P > |t| = 0.5943，顯示三維培養傳代細胞的染毒實驗滴度與貼壁細胞培養的細胞中毒后血凝試驗效價結果無顯著性差異。

2.4 甲型流感病毒細胞培養后核酸檢測結果比較：將9例經直接檢測甲型流感核酸陽性標本分別接種三維培養和貼壁培養的MDCK細胞，CO2培養，觀察中毒后，重新抽核酸進行核酸分型檢測，均為H3型季節性流感。結果見表三。A組為單層細胞貼壁培養中毒液檢測，B組為三維細胞培養后中毒液檢測。

以上結果用配對T檢驗統計分析，結果P > |t| = 0.3956，貼壁細胞培養和三維細胞培養結果無顯著性差異；細胞培養后病毒大量增殖，使得核酸分型檢測結果更明確。

3 討論

流感病毒的監測包括核酸檢測和細胞培養兩方面。細胞培養是對流感病毒對細胞的敏感性，抗原性分析的必須方法，也可以通過細胞中毒實驗使得某些直接核酸檢測結果不明確的標本得以明確病毒核酸的分類，通過較少病毒載量的標本在細胞中增殖也是對一些不明分類的流感病毒深入研究的基礎。

三維細胞培養技術在細胞培養上更貼近于自然狀態，細胞生物活性較高。[3]利用該技術得到細胞對已病毒培養更為高效。三維細胞培養技術可以在病毒培養中得到極大的發展。對于三維結構下細胞生物活性較高狀態的細胞染毒實驗可能大大提高流感病毒染毒效果。得益于三維培養技術的革新，使得該技術能夠培養在傳統培養板上難以培養的細胞；細胞生長狀態更加接近于體內狀態，利于細胞的極化與功能化[4]；省去消化、離心等操作，簡化細胞培養流程；可以在短時間內獲得大量細胞；細胞的一致性可以得到保障；微載體透光性好，沒有自發熒光，不必與細胞分離就可以進行后續觀測；細胞培養表面大，可以獲得高密度細胞；微載體材質與結構適合細胞生長，表面提供各種蛋白包被可滿足特殊細胞培養的需求；微載體內嵌磁性顆粒，便于外加磁力進行操控；大大減少耗材用量，降低耗材成本，并且有利于環保；減少研究者在細胞培養上花費的精力。

本次研究中，三維細胞培養方法不僅比普通單層細胞培養有更多的細胞收獲，而且在病毒敏感性，血凝效價實驗等各方面與單層細胞培養方法無顯著性差異。

三維細胞培養技術在流感病毒培養中得以較好的應用，該技術在細胞傳代、細胞復蘇、細胞凍存等細胞技術都已經較為成熟。特別是細胞傳代的應用，細胞培養技術與新材料新方法結合的全新思路解決和突破了傳統貼壁細胞培養技術細胞傳代細胞得率過低的技術瓶頸，對于我們實驗室高通量的流感病毒監測、培養具有十分重要的意義。

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[3] ALVIA，STUPACK D G，Cell survival in a three-dimensional matrix[J].Methods Enzymol，2007，426：85-101.

篇（7）

與ESA均為高水平表達，而CD184表達則在12個細胞系之間有差異。在單個細胞培養中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態，12個細胞亞系均源于單個細胞形成的完全克隆，均可進行連續傳代與擴增，而部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡。結論 Tca8113M1細胞系中可能存在癌干細胞，而單細胞培養可形成完全克隆并建立細胞亞系，是進行舌癌干細胞后續研究重要的細胞培養模式。

[關鍵詞] 單細胞； 有限稀釋法； 舌癌干細胞； 完全克隆

[中圖分類號] Q 21 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細胞是癌組織中一小群具有干細胞特性的細胞，具有自我復制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強，少量細胞即可形成體外移植瘤[1]。近年

有關腫瘤發生、轉移、耐藥與復發等諸多難題均從癌干細胞的角度進行研究。這種研究的基礎和前提是明確癌干細胞的標志或分離出癌干細胞，以提供研究的靶細胞。目前已發現多種永生性癌細胞系中存在有癌干細胞，Tca8113M1舌癌細胞系同樣可能存在有癌干細胞，可以作為舌癌干細胞的研究對象。鑒于癌干細胞獨特的自我復制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細胞系為研究對象，采用有限稀釋法分離出單個舌癌細胞進行體外培養，利用癌干細胞的自我復制能力進行分裂增殖，形成預期的單細胞克隆，進一步形成細胞亞系，以此證明Tca8113M1

舌癌細胞系中存在癌干細胞的可能性，同時檢測細胞亞系癌干細胞標志的表達情況，觀察不同細胞亞系的生物學特性，并且動態觀察單細胞培養中細胞克隆形成的規律，為從Tca8113M1細胞系中分離舌癌干細胞提供前期實驗依據。

1 材料和方法

1.1 舌癌細胞系來源

人舌癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系，四川大學華西口腔醫院贈送。右江民族醫學院腫瘤分子生物學實驗室在此基礎上建立了轉移人舌癌細胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培

養基（Gibco公司，美國）；PE標記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗人細胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗體，PE/cy5標記抗人CD184抗體，同

型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養箱（日本三洋公司），流式細胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日

本）。

1.3 體外單細胞培養、建系及細胞克隆生長的動態

觀察

采用有限稀釋法進行體外單細胞培養與建系。Tca8113M1細胞經復蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，轉移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個孔有1個細胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個細胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉移至6孔板擴增培養后，在培養瓶中反復傳代建立細胞亞系。此外，在此培養過程中動態觀察單個細胞形成細胞克隆的形態與生長情況，觀察時點分別為3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌細胞亞系成瘤性檢測

建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細胞亞系細胞，選取形態良好的生長期細胞，在生長旺盛時接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細胞，800 r?min-1離心3～

5 min，棄上清液，計數細胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養液按每毫升1×107個細胞的密度稀釋細胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細胞接種于皮下，以皮下結節直徑超過1.0 cm為成瘤標準。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細胞亞系組，共12個亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細胞組，6只，為母系細胞系對照組；3）Tca8113舌癌細胞組，3只，為來源細胞系對照組。

1.5 流式細胞術檢測舌癌細胞亞系癌干細胞相關標

志CD44、CD184、ESA的表達情況

將舌癌細胞（密度為每毫升1×106個）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細胞吹散，將細胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標記抗人CD44、FITC標記抗人ESA、PE/cy5

標記抗人CD184）各5 μL，置于避光環境下室溫孵育30 min，然后于流式細胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達情況。

2 結果

2.1 Tca8113M1細胞體外單細胞建系培養

Tca8113M1單細胞培養12 h后，細胞貼壁；24 h后部分細胞出現變大變薄、空泡樣變等老化現象；3 d后，有7個孔的細胞出現增殖分裂現象；7～10 d后有12個孔的細胞開始增殖為單個或數個完全細胞克隆（克隆形成過程見圖l）。

培養4～6周后，細胞基本達到穩定生長并增殖的狀態，以癌細胞的克隆樣生長為主，細胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細胞，核分裂象多見。待培養孔接近80%鋪滿時，將細胞轉移至6孔板上擴增培養，1～2周后轉移至培養瓶中繼續傳代培養，穩定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細胞，并在96孔板中進行體外傳代建系培養，獲取12個細胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1細胞體外單細胞培養形成細胞克隆

的動態觀察

以3 d和1、2、3周為觀察時點，發現單個細胞形成細胞克隆的形態主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細胞亞系的細胞均源于單個細胞形成的完全克隆，均可以進行連續傳代與細胞培養擴增，而其他單個細胞培養形成的部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡，未能連續傳代進行細胞擴增。3種克隆在培養過程中的變化情況如下。1）完全克隆：細胞之間緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時在細胞克隆中央出現細胞重疊生長現象（圖2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形態界于旁克隆與完全克隆之間，細胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細胞克隆疏松，形狀消散，

有轉變為旁克隆的趨勢（圖2中B1～B4）；3）旁克隆：

細胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細胞老化（圖2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌細胞亞系成瘤情況

將舌癌細胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結節，表面光滑、質硬、可活動；2周后可見皮下結節生長迅速；3～4周后皮下結節最大直徑達1.0 cm以上。含對照組在內的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞亞系癌干細胞相關標志

CD44、CD184、ESA表達情況

流式細胞術檢測結果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細胞亞系ESA的陽性表達率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個亞系的CD184表達存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。

3 討論

本研究利用有限稀釋法等經典的細胞培養技術，以舌癌Tca8113M1細胞系為研究對象，隨機選取192個舌癌細胞，在96孔板中進行單細胞培養，經過長期傳代培養，共建立12個舌癌Tca8113細胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強的成瘤性。進一步檢測12個Tca8113細胞亞系的癌干細胞相關標志，結果發現：CD44與ESA均為高水平表達，陽性表達率多在90%左右，而CD184的陽性表達率則各有不同。據此結果可以結合癌干細胞的生物學特性對本實驗獲得的細胞系進行分析。

本研究發現：舌癌Tca8113M1細胞系中有6.25%的單個細胞可以進行自我分裂、增殖，形成細胞亞系。還有研究[3]發現：Tca8113細胞連續經過兩次單細胞培養實驗，其中具備分裂增殖活性的細胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細胞系中，具備持續增殖能力的細胞占整個群體的比例都較少。根據目前的文獻[4]報道，在癌細胞群或組織中，癌干

細胞比例為0.01%～5%；體外培養的永生化癌干細胞系中，癌干細胞的比例可能偏高一些。本研究采用經典的有限稀釋法獲取單個細胞，這種細胞表現出強大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強的細胞亞系。這些單個培養的細胞是否就是癌干細胞尚需進行單細胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應該包含有癌干細胞。腫瘤干細胞的概念于20世紀60年代提出，并據此建立了腫瘤細胞克隆實驗。本研究在單個細胞培養中也發現，單細胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個細胞克隆后擴大生長，并且在周圍形成小的細胞克隆，最后融合成片，但究其細胞來源就是一個癌細胞而已，所有后續的細胞克隆與癌細胞就是源于它，所以可以認為該細胞具有癌干細胞的潛質，可以考慮從癌細胞系中篩選癌干細胞。

在12個Tca8113細胞亞系中，為明確其癌干細胞相關標志的表達情況，為后續舌癌干細胞的篩選提供前期實驗數據，本研究綜合文獻報道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細胞相關標志進行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌等上皮組織的癌干細胞的相關標志，CD184是胰腺癌干細胞的相關標志；ESA則是上皮來源的癌干細胞標志，而且屬于細胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細胞亞系中，

CD44與ESA均處于高水平表達，而CD184的表達則高低不一，其中亞系間均數差值最大者接近60%。從這3個指標的表達情況來分析，可以進行如下推測：1）CD44與ESA是不同細胞亞系共有的標志，提示這些細胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達提示Tca8113細胞系中存在細胞異質性，但從其比例來看，大致有3個等級，即15%、30%、50%以上，提示其生物學特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細胞研究的候選細胞群體進行研究。

此外，在單個細胞培養基礎上建立細胞亞系的過程中，筆者發現單個細胞形成細胞克隆的形態與細胞最后成系關系密切。在單個細胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細胞亞系，而且這些細胞亞系表現出腫瘤的異質性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴增培養過程中逐漸老化或消亡。這一結果可進行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個細胞確定為舌癌干細胞，而其形成的完全克隆則是癌干細胞自我更新與增殖的結果，其中可能富含癌干細胞。這一觀點也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經膠質瘤等相關研究[7-12]所證實。這些研究發現完全克隆細胞可以高表達癌干細胞標志；接種1 000個完全克隆前列腺癌細胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養的癌細胞球在消化后進行單細胞培養，可以形成高比例的完全克隆。有學者[13]進一步在頭頸腫瘤細胞系中發現，CD133與CD44陽性表達的癌細胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細胞的標志。由此可見，完全克隆為癌干細胞的自我更新方式與富集、純化癌

干細胞及癌干細胞標志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細胞研究中逐漸被應用和關注[11]。此外，針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個細胞培養1～2周時形成，最好不要超過3周；擴增培養后，可使癌干細胞比例減少或分化細胞比例增加，從而影響對癌干細胞行為學的觀察。

本研究屬于尋找舌癌干細胞的前期性和階段性實驗，但是結果很有意義，這12個細胞亞系表明了Tca8113M1細胞系中有存在舌癌干細胞的可能性，而其最初的來源細胞系Tca8113也應存在癌干細胞。結合細胞克隆形態分析的單個癌細胞培養模式可為深入研究舌癌干細胞提供細胞研究平臺。

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篇（8）

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）27-10-03

Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium

MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2

1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China

[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.

[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR

表皮干細胞為皮膚組織中的專能干細胞，是一種成年組織干細胞[1]，可增殖分化為表皮中各種細胞成分，保持皮膚正常的表皮結構。表皮干細胞的分化方式有兩種：對稱分裂和不對稱分裂。前者分裂成兩個和母細胞相同的子代干細胞；而后者則分裂成一個子代干細胞和一個與母細胞不同的短暫擴增細胞（TAC）[2]，TAC屬定向祖細胞。近年來干細胞療法已成為治療多種疾病的新途徑，可替代、修復、加強受損的組織或器官的功能[3]。本研究應用組織工程學技術將表皮干細胞體外定向誘導分化為結膜上皮細胞，通過對目的細胞生物特性的檢測，探討其在臨床眼表結膜重建治療中的應用前景。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1人皮膚材料包皮標本來自中山大學第一附屬醫院泌尿外科包皮環切術患者，無泌尿系統疾病感染，患者年齡18～30歲，所取包皮標本均得到患者知情同意。

1.1.2結膜組織取自尸體眼正常結膜組織。

1.1.3試劑和儀器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；熒光定量試劑盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司（美國）；TRIZOL® Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；RNA提取反轉錄PCR試劑盒購自Promega公司（美國）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR儀（Stratagene公司，美國）；MJ Research OpticonTM4熒光定量PCR儀（美國）。

1.2方法

1.2.1飼養細胞的培養取尸體眼結膜，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍，于無菌超凈臺剪除結膜下筋膜組織，將其上皮面向上平鋪于無菌培養皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，棄去消化液并用無菌虹膜恢復器刮取上皮組織，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化約20min，待倒置顯微鏡下見到上皮細胞充分消化為多個單細胞狀態時加入上皮細胞培養液中止消化，收集細胞懸浮液，置于離心管內，以1500r/min離心5min，獲得消化的結膜上皮細胞，將其調整為1×104個/mL，在6孔Transwell培養板insert池中加入1mL結膜上皮細胞懸液飼養細胞組為實驗組，對照組insert池中無飼養細胞，僅為相同體積的上皮細胞培養液。

1.2.2表皮干細胞的分離、篩選、培養取無菌手術獲得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L兩性霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液浸泡30min，無菌超凈臺剪除皮下組織，并剪成2mm×4mm皮條，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃過夜。次日用眼科鑷撕取表皮皮片，D-Hank’s液沖洗3次，并用眼科顯微剪將其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使細胞脫落，加入上皮細胞培養液中止消化，200目細胞篩過濾得細胞懸液，收集細胞懸浮液置于離心管內，以1500r/min離心5min，獲得消化所得的皮膚上皮細胞。將其以1×106個/mL密度接種于Ⅳ型膠原（100μg/mL）鋪底的培養瓶置于5% CO2、37℃細胞培養箱中待細胞貼壁20min后，去除未貼壁細胞，加入新的上皮細胞培養液，5% CO2、37℃細胞培養箱培養，1～2d換液一次。

1.2.3表皮干細胞與結膜上皮細胞共培養的誘導分化取1～2代表皮干細胞作為實驗細胞，以5×106個/mL接種于6孔Transwell培養板中，實驗組insert池中加入1mL結膜上皮細胞（細胞濃度為1×104個/mL）作為飼養細胞；對照組insert池中僅為相同體積的上皮細胞培養液，5% CO2、37℃細胞培養箱培養1、3、5、7d后，棄細胞培養液，分別取對照組和實驗組細胞提取RNA，進行實時定量RT-PCR檢測目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表達情況。

1.2.4細胞總RNA的提取吸出6孔Transwell培養板中的培養液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振蕩混勻，15～30℃溫育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振蕩15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃離心樣品15min（＜12 000g），將上層水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃離心（＜12 000g），棄上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗滌，振蕩樣品，然后7 500g離心樣品5min（如果用來富集小分子RNA，則不用75%乙醇洗滌，直接進入下一步），空氣干燥RNA 10min，用適量RNase free水溶解，于60℃溫育10min，置于-80℃備用。

1.2.5引物的構建按照參考文獻[4]構建設計：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。

1.2.6PCR擴增取3μL逆轉錄反應產物做模板，根據試驗目的加入相應的正向引物和反向引物。PCR反應總體系為20μL。條件為95℃ 5min，1個循環；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30個循環；72℃ 10min，1個循環。

1.2.7熒光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書進行。取1μL逆轉錄反應產物做模板，20μL反應體系，引物濃度為10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用雙蒸水補平至20μL。反應程序為94℃ 10s，1個循環；94℃ 5s，58℃ 31s，讀板，40個循環。數據分析采用2-CT方法。

2結果

Realtime RT-PCR的結果見圖1、圖2。結果可見實驗組表皮干細胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表達明顯上調，分別為（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表達上調（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。與對照組相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表達都有顯著性上調。

圖1表皮干細胞中β2-微球蛋白mRNA的表達水平5d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調（300±26）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6

圖2表皮干細胞中CK13 mRNA的表達水平5d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調（480±110）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6

3討論

角蛋白（keratin）是上皮細胞異性的中間絲成分。已知的細胞中表達的各種角蛋白家族亞單位成員具有組織特異性，并且和細胞的分化相關[5]。例如：Krenzer等[6]報道：在正常結膜上皮細胞中表達角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究報道：通過對38例正常結膜組織的上皮細胞建立的cDNA文庫，檢測出角蛋白K13是結膜細胞轉錄中表達最豐富的基因，且該基因與細胞骨架的合成有關，并認為K13有可能是有關眼表結膜細胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也證明：在結膜上皮細胞的免疫組化鑒定中結膜上皮細胞可被特異性角蛋白K13抗體標記，而在皮膚干細胞中并無相應抗體的表達[8]。

β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。雖然有關該種蛋白的功能尚未明確，但是該蛋白存在于淚液中并可能來源于結膜上皮細胞中。并且在正常狀態下淚液中的β2-微球蛋白濃度明顯高于炎癥時淚液中濃度。Dota等[7]研究中也同時檢測到β2-微球蛋白也是結膜上皮細胞轉錄較高的基因，因此本研究將CK13和β2-微球蛋白作為結膜上皮細胞標記性（特異性）的高效表達基因。

近年來，相關文獻[9-11]報告了通過組織工程技術將成體干細胞體外合成生物替代品，并對其組織功能改良用于眼表重建的臨床治療新技術。然而，成功的眼表重建依賴于兩個重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干細胞；其二，干細胞的載體組織。本研究中應用具有高分化、高增殖能力的表皮干細胞為種子細胞，從而保證眼表重建治療中能獲得可靠的細胞源。我們早期的相關研究中[4]報告應用同源異體的結膜去細胞基質膜為干細胞載體膜，不僅可保證具有良好的組織相容性，而且也確保在體外模擬形成結膜上皮細胞增殖的組織微環境。從而誘導表皮干細胞定向分化、增殖。

研究結果顯示經誘導分化的表皮干細胞在短時間內具有結膜上皮細胞的特異性基因CK13及β2-微球蛋白的高表達，提示該實驗方法可誘導表皮干細胞形成特異性短暫擴增細胞（TAC），并能定向分化為類結膜上皮細胞。因此，在臨床上眼表重建的干細胞療法應用中，該方法不僅可保證獲得充足的目的細胞來源，而且確保目的細胞具有穩定的生物學特性。在眼表結膜組織的重建及生理功能恢復的臨床治療中提供有效的組織來源。但是，該研究方法中誘導分化的表皮干細胞作為種子細胞能否合成人工結膜生物膜活體動物眼表的存活狀況及生理功能重塑方面的問題，還需要進一步的研究探索。

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篇（9）

誘導多能干細胞培育出肝臟

英國《自然》雜志2013年7月3日報道，日本橫濱市立大學谷口英樹研究小組與美國西奈山醫學院研究人員合作，利用人類誘導多能干細胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠體內，結果這些肝芽成功生長成微型人類肝臟或稱“迷你肝臟”，并像健康器官一樣具有正常的肝功能。這是世界上首例用誘導多能干細胞培養的立體肝臟。在此之前，已經有研究小組能夠用誘導多能干細胞培養出肝細胞，但是還不能培養出可以在人體內發揮功能的立體結構肝臟。

日本和美國研究人員利用人類誘導多能干細胞培養的肝臟從嚴格意義上來說還不是肝臟，但是可以看成是微小肝臟，它們的直徑只有4毫米～5毫米，卻表現出了肝臟的生物活性和生理功能。

研制的過程是，將人類皮膚細胞重編程為誘導多能干細胞，并且讓其分化成表達肝臟基因的早期肝細胞。然后在培養基中加入從臍帶血中提取的內皮細胞和制造骨骼、軟骨和脂肪的間充質干細胞，內皮細胞的作用是指揮血管排列和生成。此后，這些細胞在培養基中自行成長為球狀的細胞團，如同人類胚胎中肝臟最初的發育一樣。兩個月后，這些細胞團快速生長成直徑為4毫米～5毫米的微小肝臟，研究人員再把這種微小肝臟移植到小鼠的皮膚下。此后，微小肝臟與小鼠的血管慢慢連接起來，最終發育成類似成體肝臟的器官。這種微小肝臟還接管了小鼠肝臟的一些正常的工作。

為了驗證這種微小肝臟是否有生理功能，研究人員對小鼠注射了兩種藥物，以檢查肝臟是否有代謝藥物的功能。這兩種藥物是抗炎藥酮洛芬和治療高血壓的藥物異哇胍。結果發現，小鼠的血液中產生了通常來自人類肝臟的代謝產物而非小鼠肝臟的代謝產物。這說明移植進小鼠體內的微小肝臟發揮了作用。

同時，研究人員還做了一個對照研究，以檢測微小肝臟是否有解毒功能，以便幫助肝功能衰竭的小鼠存活。實驗用了兩組小鼠，一組小鼠的每一只體內都植入了12個誘導多能干細胞培養的微小肝臟，另一組小鼠作為對照組，未植入微小肝臟。研究人員對兩組小鼠都注射白喉毒素。結果，移植了微小肝臟的一組小鼠有近1/3存活超過了40天，而對照組小鼠在10天內都死亡了。

此外，研究還發現，誘導多能干細胞生成的微小肝臟能夠分泌肝臟的特異性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且產生人類特異性代謝物。誘導多能干細胞生成的微小肝臟最為重要的特點是，它很快就能與附近的血管融合，從而獲得受體血液系統的支持。這是器官移植最重要的一步，因為有了受體血液系統的支持，而且不受到受體免疫系統的排斥，移植的器官就會持續生長，成為受體體內的一員。因此，盡管這種能首次連接到受體血液系統的具有復雜生理功能的器官還比較微小，但已經是再生醫學的一個重要里程碑。

當然，未來如果能進一步表明誘導多能干細胞培養的微小肝臟移植進人體后不受人的免疫系統排斥，那么微小肝臟就可以移植給人體，至少可以取代成人30%的正常肝臟功能。這對于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意義。當然，如果誘導多能干細胞培養肝臟的技術進一步成熟和有效，則有可能培養出像成人肝臟那么大的肝臟，器官移植將會獲得突破性進展，因為病人再也不用長時間等待供體器官了。但是，要達到這一步可能還要等上較長時間。

培育簡單器官和組織更容易

由于肝臟具有較為復雜的多種生理功能，如解毒功能、代謝功能、分泌膽汁、免疫防御功能等，這就意味著用干細胞培育肝臟更具挑戰性和復雜性。因此，在用干細胞培育較為簡單的器官方面，應當更有收獲。事實也完全證明了這一點。

現在，多個國家的研究人員已經能用誘導多能干細胞培育多種簡單的器官，如血管、肌肉、毛囊等。

美國麻省總醫院史迪爾腫瘤生物學實驗室主任雷克思·杰恩等人利用人類誘導多能干細胞衍生的血管前體細胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且這些血管維持活性長達280天。

用人類誘導多能干細胞培育的血管主要可以用于治療心血管病和糖尿病導致的血管損害。比如，糖尿病晚期常導致病人的大血管并發癥，如動脈粥樣硬化、冠狀動脈狹窄（可導致冠心病甚至心肌梗塞）、供應大腦的血管狹窄（可導致腦缺血甚至腦梗塞）、供應下肢的血管狹窄（可導致下肢的疼痛和壞疽），這時就可以用再造血管的方法來治療晚期糖尿病人。同時，還可以用新血管為新生組織提供血液供應。

過去的一些研究顯示，利用人類誘導多能干細胞能生成構建血管所需的內皮細胞，但是，將這些細胞導入到小鼠身上卻無法形成持久的血管。于是，麻省總醫院的研究人員利用來自健康成人以及1型糖尿病病人的人類誘導多能干細胞，在小鼠大腦外表面和皮膚下生成了血管。研究小組采用了一種最初用于人類胚胎干細胞衍生內皮細胞的方法，以此來擴大和培養人類誘導多能干細胞，然后讓這些細胞群生成能夠形成血管的內皮細胞。

隨后，研究人員把這些內皮細胞與間充質前體細胞（可生成必要的結構細胞）一起移植到小鼠大腦的表面。在兩周內，移植細胞形成了血液灌注的血管網絡，它們與鄰近的天然血管一樣發揮了功能，并在小鼠體內持續發揮功能長達9個月。此外，研究人員也用同樣的方法在小鼠皮膚下移植內皮細胞與間充質前體細胞，結果也生成了功能性的血管。但是，在皮膚下的移植需要移植更多的細胞，約為移植到大腦的5倍以上，并且生成的血管的壽命比在大腦生成的血管壽命短。

這項研究還表明，來自健康人的細胞和患1型糖尿病患者的人類誘導多能干細胞衍生的內皮細胞都可以生成能長期維持功能的血管。但是，不同的人類誘導多能干細胞和包括來自同一患者的不同細胞系在生成血管的潛力上有差異，因此，還需要更深入地了解干細胞生成血管的更多機理，而且需要找到更好的方法來操控生成特定器官所需的特異內皮細胞類型。

當然，由人類誘導多能干細胞生成的血管是否能應用于糖尿病病人，還需要在安全性和實用性方面進行更深入的研究，但畢竟這項研究已經讓人們看到了一些希望。

另一方面，用干細胞培養成熟的心肌也有了新的突破。過去，在培養基中培養的心肌細胞并不像人體心肌細胞那樣具有生理功能，例如傳導生物電信號和收縮。為了解決這些問題，美國杜克大學生物醫學工程系的尼納德·伯薩克等人采取了一種新的方法來培育心肌，即用胚胎干細胞來培養心肌。胚胎干細胞不同于誘導多能干細胞，可能會受到倫理制約，而且所能獲得的胚胎干細胞也有限，當然其全能分化和生長的效果優于誘導多能干細胞。

研究人員在實驗室中把人胚胎干細胞分化得到的心肌細胞放入三維水凝膠中。此后，心肌細胞自行組裝成心肌束，形成了纖維細胞在外、內皮細胞穿插其中的三維結構。而且，這種組織并非是心肌細胞的堆積，而是一塊8毫米×8毫米的心肌組織，并且達到了與體內心肌細胞類似的功能指標。通過注入不同的藥物可以檢測心肌電傳導性能的變化和檢測藥物對心肌收縮能力的影響。由此證明，這種由胚胎干細胞培養的心肌組織不僅可以傳導生物電流，而且可以自主搏動。

研究人員認為，這種心肌組織的結構和功能都超過了以前的人工心肌，也是迄今為止和人體組織最接近的人造心肌薄片。雖然這是依靠胚胎干細胞培養的，但是，通過仔細總結培養的機理，未來可以通過提取心臟病人的皮膚細胞以獲取誘導多能干細胞，再由后者來培養特異的心肌組織或心臟，如此，則可以修補病人的壞死心肌，或者直接為病人移植用其自身的皮膚細胞培養的心臟。

培育血細胞

誘導多能干細胞還能培育更多的血細胞，以用于輸血、診斷和治療疾病。

人的血液由血漿和血細胞組成。血漿相當于結締組織的細胞間質，為淺黃色半透明液體，其中除含有大量水分以外，還有無機鹽、纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各種營養物質、代謝產物等。血細胞則分為紅細胞、白細胞、血小板。人的血細胞總是在不斷地新陳代謝。紅細胞的平均壽命約120天，有粒白細胞和血小板的生存期限一般不超過10天。淋巴細胞的生存期長短不等，從幾個小時到幾年。一般而言，血細胞及血小板來自造血器官，紅細胞、有粒白細胞及血小板由紅骨髓產生，無粒白細胞則由淋巴結和脾臟產生。但是，由于疾病和造血功能異常會導致一些血液方面的疾病，如貧血。

貧血是指人體外周血液中紅細胞容量減少并低于正常范圍下限的一種疾病，但是由于紅細胞容量測定較復雜，臨床上常以血紅蛋白（Hb）濃度來代替。在中國一般把成年男性Hb

因此，貧血的根本原因是紅細胞減少，因而導致血紅蛋白減少，血液攜氧供氧能力下降，這就會對全身造成不同程度的影響。例如，造成神經系統的損害，表現為頭昏、耳鳴、頭痛、失眠、多夢、記憶力減退、注意力不集中等；貧血更影響呼吸循環系統，表現為氣急或呼吸困難，并且有心悸、心律失常和心功能不全；貧血也影響消化系統，因為貧血時消化腺分泌減少甚至腺體萎縮，進而導致消化功能降低、消化不良，出現腹部脹滿、食欲減低、大便規律和性狀的改變等。

長期以來，治療慢性貧血的效果并不如意。研究人員也在尋找新的方法，例如輸血和單獨輸入紅細胞。但是，輸血和輸入紅細胞也可能發生排異反應和輸血反應，甚至染上其他傳染性疾病。如果能用病人的皮膚細胞產生誘導多能干細胞，再由后者生成紅細胞，就可以把紅細胞輸入病人體內，治療貧血。

篇（10）

干細胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一類細胞，目前學習者對動物干細胞的理論和應用知識掌握較多。由于植物細胞的全能型，長期以來很多學習者誤認為植物中不存在干細胞，再加上教師對干細胞這部分內容的講授不透徹，造成學習者對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念往往混淆不清，存在植物干細胞認知上的錯誤，因此很有必要對植物干細胞的相關知識進行總結。

1.植物干細胞

1.1植物干細胞的概念和特征。植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞，具有自我更新和再生能力。植物干細胞具有很強的自我更新能力，并且可以分化為特化的細胞類型，這些特化的細胞產生新的植物器官（根、莖、葉和花等）。這些細胞表型的變化是由影響植物功能的基因表達變化引起的，受到內源性和外源性的信號共同調節[1]。植物干細胞的特征包括：能夠形成所有分化細胞的類型；具有自我更新的能力，維持干細胞的數量；位于分生組織。

1.2植物干細胞與動物干細胞的比較。在動物中，通常將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有全能性，它可以分化形成所有的成體組織細胞，甚至發育成為完整的個體；成體干細胞（如造血干細胞、神經干細胞、間充質干細胞、皮膚干細胞等）大多為多能干細胞，它們具有多向分化的潛能，可以分化形成除自身組織細胞外的其他組織細胞，真正具有全能性的細胞是受精卵和其分裂產生的子細胞。與此相比，許多植物干細胞具有旺盛的再生能力，在干細胞的整個生活周期中能使植物生長并且產生新的器官（如植物莖端分生組織中的干細胞和根端分生組織中的干細胞）[2]。

1.3植物干細胞與植物愈傷組織細胞的比較。植物愈傷組織細胞是由成體細胞經過脫分化而形成的具有分化能力的細胞，雖然愈傷組織的分化能力與植物干細胞相似，但它們在來源、細胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈傷組織細胞來源于異質性的體細胞，它是體細胞對損傷的暫時響應，是一個臨時獲得刺激的細胞，盡管愈傷組織具有干細胞樣屬性，但愈傷組織不易維持穩定的細胞分裂[3]。而植物干細胞來源于植物分生組織的同質性細胞，它們在植物的整個生命周期可以產生并形成新的組織和器官。

2.植物干細胞的類別與調控

根據分生組織的種類，植物干細胞可分為莖尖分生組織中的干細胞和根尖分生組織中的干細胞。

2.1莖尖分生組織中的干細胞。莖尖分生組織包括中心區和中心區下方的帶狀區。中心區包括上部干細胞區和下部的組織中心（即干細胞區下部靠近帶狀區的小細胞群）。干細胞分裂時上部的干細胞分裂成兩部分子細胞，一部分干細胞后裔留在中心區并保持多能性；另一部分細胞則離開莖尖分生組織的中心區，但保持較快的分裂速度，最終分化為葉或者花原基器官，為側生器官的生長和分化提供保證[4]。目前已知的位于干細胞周圍“組織中心”的WUS（WUSCHEL）是保持莖尖干細胞特征的必要信號分子，它參與對莖尖干細胞的穩態調控，使整個植物莖尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化。

2.2根尖分生組織中的干細胞。靜止中心位于根尖分生組織中心，干細胞則圍繞在靜止中心細胞周圍。靜止中心作為組織中心維持周圍干細胞的穩定和功能，靜止中心周圍的干細胞分布于中柱鞘外側，維管干細胞形成維管組織、皮層/內皮層干細胞，進而形成皮層、內皮層與根冠干細胞，然后形成根冠細胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作為最主要的干細胞決定因子，特異的表達于根端分生組織的靜止中心，參與對根端干細胞的穩態調控，使整個植物的根尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化[4]。

3.植物干細胞的應用

3.1生產天然產物，開發藥品或者化妝品。傳統的植物細胞培養存在細胞生長緩慢、生產成本高等問題，而植物干細胞培養具有遺傳穩定、細胞生長率和生長模式穩定、凝集程度低等優點，可以用來大量生產有用的植物天然產物，并用于藥品、功能性食品、化妝品中。如懸浮培養紫杉干細胞可以生產松香烷型三環二萜、美麗紅豆杉素A和美麗紅豆杉素B等產物，以達到抑制腫瘤血管的生成和抗癌作用，而且其產值遠大于傳統細胞培養的產值，具有很好的開發前景[5]。

3.2植物細胞系庫的建立和利用。一般的植物細胞凍存后存活率低，恢復生長能力慢，因此限制其在植物細胞培養中的應用。植物干細胞系在低溫儲藏方面有很大的優勢，不僅有高的存活率，而且在低溫儲藏前后遺傳物質沒有變異，是植物細胞系庫建立的很好材料。細胞系庫的建立不僅會使研究材料的供應得到滿足，而且使植物細胞系的研究周期縮短，并在植物種子資源的保存和利用方面發揮重要作用[6]。除了以上應用外，利用植物干細胞還可以進行植物干細胞的分子調控機制和分子設計育種等方面的研究。

4.結語

植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞，它們具有自我更新和再生能力。根據目前學習者對植物干細胞認識不足的實際，本文對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念進行了辨析，并對植物干細胞的分類及應用進行了論述。學習者清楚植物干細胞、植物愈傷組織細胞和動物干細胞的概念后，在學習植物干細胞的理論和應用等方面時才能正確理解相關的知識點。

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篇（11）

上世紀80年代，科學家在干細胞的研究中，指出了可自我修復的全能性胚胎干細胞對神經細胞研究的重要作用，但是卻因為其倫理問題而難以繼續研究。

2007年，科學家利用干細胞技術，在培養皿中成功地將皮膚細胞培養成誘導多功能干細胞，這種干細胞具備類似胚胎干細胞的功能，能夠根據需要分化成不同的細胞。早期的神經細胞培育正是在這種迂回技術下實現的，但是由于這種技術誘導多功能干細胞不僅轉化時間過長、程序繁雜，而且容易引發癌癥等風險，所以未能成為成熟的技術。

2010年，科學家繞開了誘導多功能干細胞的繁雜步驟，成功將實驗鼠的皮膚細胞直接轉化成神經細胞，并在此基礎上，成功將人體皮膚細胞直接轉化成神經細胞。

培養神經細胞的新技術